2023 年美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的對比研究得出一個結(jié)論是并非所有商業(yè)化支原體檢測試劑盒都能滿足替代傳統(tǒng)方法的要求，研究對市面上 5 款主流試劑盒（ATCC、梅里埃、賽默飛、羅氏、MB）進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)不同試劑盒對不同支原體菌株的檢測靈敏度差異明顯，部分產(chǎn)品無法達(dá)到宣稱的≤10 CFU/mL 檢測限（符合歐、日藥典替代培養(yǎng)法的要求）。例如，ATCC 試劑盒對萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體的檢測限只為 100 CFU/mL，MB 試劑盒對硬蜱螺原體無法檢出（>1000 CFU/mL）。這一現(xiàn)象表明，試劑盒的檢測性能與支原體菌株特性密切相關(guān)，因此企業(yè)需根據(jù)待測樣品的原輔料來源和檢測目的，對試劑盒進(jìn)行嚴(yán)格的性能驗證，避免因檢測限不達(dá)標(biāo)導(dǎo)致質(zhì)量風(fēng)險。 支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株對支原體檢測試劑盒的選擇、使用及驗證至關(guān)重要。重慶疫苗產(chǎn)品支原體檢測方法學(xué)驗證

目前支原體檢測主要有培養(yǎng)法、指示細(xì)胞培養(yǎng)法和核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）法三類，三者在性能與適用場景上差異明顯。培養(yǎng)法作為檢測金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度極高，但檢測周期長達(dá) 28 天，手動操作需數(shù)天，依賴較高水平的操作技能，且因使用活菌株作為陽性質(zhì)控，污染風(fēng)險高，需在特殊實驗室開展，檢測前還需進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度驗證。指示細(xì)胞培養(yǎng)法為藥典認(rèn)可的傳統(tǒng)方法，成本較低，但檢測周期仍需 14-20 天，靈敏度偏低，同樣存在活菌株污染風(fēng)險，無法滿足快速放行需求。NAT 法（核酸擴(kuò)增法）檢測周期只需 3-7 小時，手動操作時間為數(shù)小時，采用滅活菌株降低污染風(fēng)險，樣本需求量少、靈敏度高，但無法區(qū)分死菌與活菌，且需要開展充分驗證，對操作人員的專業(yè)技能有一定要求，已逐步成為生物制藥企業(yè)產(chǎn)品放行檢測的youxia方案。 重慶疫苗產(chǎn)品支原體檢測方法學(xué)驗證細(xì)胞療法產(chǎn)品時效短，需用 核酸擴(kuò)增NAT 法快速檢測支原體，滿足放行時效。

檢測限驗證是支原體 NAT 方法（核酸擴(kuò)增法）合規(guī)性的關(guān)鍵要求，法規(guī)明確界定需為每種目標(biāo)支原體確定陽性檢測臨界值。驗證流程需滿足嚴(yán)格的實驗設(shè)計：每種支原體至少進(jìn)行三次單獨的 10 倍梯度稀釋，每次稀釋后需制備平行管檢測，再確保各稀釋濃度獲得 24 個檢測結(jié)果。陽性臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)為，該濃度下至少 95% 的試驗運(yùn)行能得到陽性結(jié)果，即 24 個樣品中需至少出現(xiàn) 23 個有效陽性結(jié)果。這一嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計旨在確保 NAT 檢測方法在實際應(yīng)用中，能夠穩(wěn)定檢出低濃度支原體污染，避免因檢測靈敏度不足導(dǎo)致的**風(fēng)險，為生物制品質(zhì)量控制提供可靠保障。

長期以來，支原體檢測主要依賴培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法，且法規(guī)通常要求兩種方法同時使用，但這兩類方法存在明顯短板——培養(yǎng)法檢測周期長達(dá) 28 天，指示細(xì)胞法也需較長時間等待結(jié)果。隨著細(xì)胞療法藥物快速發(fā)展，其上市周期短、貨架期有限的特點，使得傳統(tǒng)方法難以滿足藥物放行的時效要求。核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）尤其是熒光探針 qPCR 檢測方法的出現(xiàn)，憑借檢測速度快、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，成為支原體檢測的理想替代方案。作為替代方法，NAT 檢測需通過嚴(yán)格驗證以達(dá)到法規(guī)要求的靈敏度：檢測限達(dá)到 10CFU/mL 可替代培養(yǎng)法，達(dá)到 100CFU/mL 可替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法，從而實現(xiàn)快速且可靠的支原體篩查。 支原體檢測需驗證專屬性，避免與革蘭氏陽性菌交叉反應(yīng)，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

支原體 NAT 檢測的特異性驗證面臨主要挑戰(zhàn)：需設(shè)計覆蓋多種支原體的 PCR 引物，而覆蓋范圍越廣，越可能因支原體與革蘭氏陽性菌的系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)性，出現(xiàn)交叉檢測現(xiàn)象，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，特異性驗證需重點排查非目標(biāo)微生物的干擾，確保檢測結(jié)果的專一性。穩(wěn)健性驗證同樣關(guān)鍵，需證實檢測方法在人為引入的微小參數(shù)變化（如反應(yīng)溫度、試劑濃度波動等）下，仍能保持結(jié)果穩(wěn)定，避免因?qū)嶒灄l件差異導(dǎo)致的檢測偏差。這兩項驗證直接決定了 NAT 方法在不同實驗室、不同操作場景下的適用性，是其獲得法規(guī)認(rèn)可的重要前提。 支原體檢測過程中，需嚴(yán)格遵循 “先陰后陽” 操作原則，避免交叉污染。江蘇重組藥物支原體檢測核酸擴(kuò)增法

申科依托 CNAS 認(rèn)證實驗室提供支原體檢測服務(wù)，可配合監(jiān)管機(jī)構(gòu)現(xiàn)場審計，確保合規(guī)性。重慶疫苗產(chǎn)品支原體檢測方法學(xué)驗證

為解決傳統(tǒng)方法的局限，各國藥典紛紛認(rèn)可支原體核酸檢測（NAT）法作為替代方案。EP 2.6.7、USP <77>、JP <G3-14-170>均明確了 NAT 法的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》3301 也規(guī)定 “可采用經(jīng)**藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法”，并明確 NAT 法替代培養(yǎng)法時檢測限需達(dá) 10 CFU/mL，替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法時需達(dá) 100 CFU/mL。NAT 法憑借檢測速度快、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，成為新型生物制品支原體檢測的理想選擇，且法規(guī)明確只要通過相關(guān)驗證，即可正式替代傳統(tǒng)方法，為企業(yè)提供了合規(guī)且高效的檢測路徑。 重慶疫苗產(chǎn)品支原體檢測方法學(xué)驗證